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更快的新克隆技术-基于成绩单的克隆

  更快的新克隆技术 - 基于成绩单的克隆

  2004年3月30日

  单链植物或动物DNA可含有数万个基因,每个基因被编程以产生对于生物体的生长或存活必需的特定蛋白质。遗传学家面临的挑战是分离单个基因并确定其功能 - 这是一个艰苦的过程,往往需要多年的实验室试验和错误。

  现在,一个国际研究团队发现了一种技术,可以显着简化某些基因的这一过程。由斯坦福大学和英国约翰英纳斯中心的科学家开发,新的程序可以使科学家在几个月而不是几年内识别出特定的基因。这种技术被称为基于转录本的克隆,在3月30日的版本中有所描述。美国国家科学院院刊(PNAS)。

  “我们相信这种方法代表了基因克隆方面的重大突破,”PNAS研究的作者写道。

  “这项技术的最大影响可能来自具有大量复杂基因组的植物,包括大多数作物物种,”Sharon R. Long,William C. Steere,Jr。

   -Pfizer Inc.斯坦福生物科学教授和该研究的共同作者。 Long还是斯坦福大学人文科学学院的院长,是细菌和植物分子生物学的权威。她和她的同事使用新的克隆技术分离和鉴定Medic藜苜蓿DNA中的基因,或者桶药 - 豆科植物的一员,与苜蓿,豆类和豌豆密切相关。

  “在六个月的时间里,我们完成了另一组几年完成的工作,我们确定了一个非常酷的基因,”斯坦福大学博士后研究员拉卡·米特拉说道,他是PNAS研究的第一作者。 “我们认为这项技术将适用于其他物种,并希望它能够加快整体生物研究的步伐。”

  反向遗传学

  Medicago DNA含有数千种基因,并使用传统方法弄清楚每种基因的作用是一个耗时的过程。 “植物遗传学家使用的标准方法 - 称为基因克隆 - 涉及以非常可控的方式破坏系统,然后追捕破碎的系统,”Mitra解释说。

  该过程开始于随机地用辐射掠过数千株植物种子,然后在实验室中种植暴露的种子。目标是培育具有明显物理突变的突变植物,然后搜索植物的DNA,直到发现感兴趣的突变基因。例如,如果研究人员想要找到负责正常根生长的基因,他们会看起来对于具有缺陷根的突变植物,然后对植物的DNA进行详尽的分析,直到它们找到导致损害的缺陷基因。

  “M. truncatula基因克隆可能需要三到五年,部分原因是它需要两代植物的交叉受精,”Mitra说。 “我想知道我们是否可以规避这种对基因的艰苦追捕。我从突变基因产生突变蛋白的前提出发 - 甚至可能完全阻止蛋白质的产生。”

  在健康的植物和动物细胞中,蛋白质的产生始于基因 - 一小段DNA由化学物质组成,这些化学物质以特定的序列排列,其中包含构建蛋白质的说明。这些指令在称为转录的过程中从DNA复制到RNA分子上。然后RNA拷贝或转录物移动到细胞的另一部分,在那里它用作制造蛋白质的模板。

  然而,突变基因带有错误的指令,产生有缺陷的RNA拷贝,细胞试图尽快消除 - 这一事实导致Mitra及其同事预测缺陷RNA只会在极低浓度的突变细胞中出现。

  但反过来也是如此吗?如果细胞产生少量的RNA转录物,这是否意味着RNA是受损基因的缺陷产物?如果是这样,研究人员可以通过反向遗传学简化整个基因鉴定过程。首先,他们会寻找低浓度的RNA并确定这些RNA分子的化学序列,然后利用这些信息在植物的DNA上找到匹配的基因。

  固氮

  在PNAS实验中,Mitra和她的同事使用他们新的基于转录本的克隆技术来鉴定植物基因,该植物基因在植物和动物的可用氮的生产中起重要作用。所有生物都需要氮来制造蛋白质。不幸的是,构成近80%大气的氮气不能被植物和动物所利用。

  然而,有土壤栖息细菌将大气中的氮转化为植物可以在其根部吸收然后转化为蛋白质的化合物 - 这一过程称为固氮。反过来,动物从植物中获取氮的主要来源,这使得细菌固氮对于所有动物和人类生命都是必不可少的。

  “我们的实验室有一个特定的目标 - 确定允许植物建立有益的固氮共生的基因,这也是可持续农业的关键,”Long指出。作为这项努力的一部分,她和她的同事一直在研究固氮细菌和植物之间发生的复杂化学信号传导。研究人员发现,苜蓿和其他豆科植物允许细菌侵入其根部,并在称为结节的肿瘤样器官中停留。

  “这种关系是互利的,”米特拉解释道。 “细菌受益,因为它们被封闭在保护性环境中 - 结核 - 它们从植物中喂食糖类。该植物受益,因为细菌将氮从空气中转化为氨,植物用来制造蛋白质。“

  豆科植物和细菌的确切沟通方式仍然是一个谜。 “由于未知原因,在识别细菌化学信号的几分钟内,植物根细胞中的钙水平开始振荡,”Mitra说。 “这些水平迅速上升,然后缓慢下降。这个过程 - 称为钙加标 - 一遍又一遍地重复,每分钟振荡一次,并持续数小时。”

  为了更好地理解这一现象,研究小组将正常的苜蓿植物与实验室培养的突变体进行了比较。 “这种突变体对我们来说特别有意义,因为它表现出钙加标行为但无法与固氮细菌建立共生关系,”米特拉说。

  利用微阵列基因芯片技术,研究人员监测了正常和突变植物中10,000个基因产生的RNA水平。 “在突变植物中,我们发现了一种叫做DMI3的基因,它产生极低水平的RNA,”Mitra说。 “DMI3基因的正常版本产生的蛋白质与烟草植物蛋白非常相似,已知它们会调节它们对钙的反应行为。”

  这一发现使研究小组得出结论,DMI3基因可能在植物对钙振荡的反应中发挥重要作用。上个月,荷兰和法国的研究小组在“科学”杂志上发表了类似的结果。但是,该小组使用的是传统的用于鉴定DMI3的基因克隆方法 - 与使用基于转录物的克隆的6个月相比,该过程至少需要4年才能完成。

  “最重要的是,”龙说。 “在固氮工作的过程中,我们发现了一种识别和克隆重要植物基因的通用方法,该方法速度快,几乎适用于任何植物物种。”

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